学术期刊发表网 位置：灵芝孢子对体外培养人卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响 时间： 2022-07-08 15:24:38 (12 )

摘要：卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其治疗以手术和化疗为主。随着治疗手段的提高，患者的生存率和生活质量也得到了一定程度的提高，但由于治疗效果仍不十分理想，其病死率仍居妇科恶性

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其治疗以手术和化疗为主。随着治疗手段的提高，患者的生存率和生活质量也得到了一定程度的提高，但由于治疗效果仍不十分理想，其病死率仍居妇科恶性肿瘤之首。因此寻求有效的治疗方法仍然是卵巢癌的研究焦点。目前中药作为卵巢癌辅助治疗手段之一越来越受到重视。灵芝孢子在我国及其他亚洲国家已被公认为治疗多种疾病的中药，并且已有大量应用灵芝孢子治疗各种肿瘤的研究报道［1 －3］。本研究观察了在不同药物浓度下灵芝孢子对体外培养人卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响，探讨其对人卵巢癌 OV2008 细胞生长抑制作用的机制，为其在卵巢癌的临床应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1． 1 材料

　　1． 1． 1 仪器: NU2600E 型 CO2培养箱( ESBE Scientif-ic MC017A1C ) ; 超净工作台 ( Microzone coinporationF40BX / SPZ41) ; EL340 酶 标 仪 ( Bio． TEK INSTＲU-MENTS INS ) ; 倒 置 相 差 电 子 显 微 镜 ( ZEISSAXIOVEＲT25) ; 荧光显微镜( NIKON TE2000-U) ; 水浴箱( Fisher Scientific ISOTEMP 210) ; 离心机( SheltonScientific CENTＲA CL2) ; 流式细胞仪( BD FACS cali-ber: BD BIOsciences E97600092) 。

　　1． 1． 2 试剂与药品: 灵芝孢子粉由加拿大 energene 天然药品有限公司提供，批号为 083668。WST-1/ECS 溶液为 Ｒoche 公司产品; ＲPMI 1640 培养基为 FisherScientific 公司产品、新生小牛血清、Hoechst 33258 为Invitrogen 公司产品; 青链霉素( 含 10 000 U 青霉素及10 000 微克链霉素) 为 Invitrogen 公司产品，批号为15140-148。台盼兰( Trypan blue) EMD 公司产品，批号EM8721-0; Trypsin、碘化丙啶 ( PI ) 、核糖核酸酶 A( ＲnaseA) 多聚甲醛溶液( Paraformaldehyde) 、为 Sigma公司产品; Bax、bcl-2、cleaved-casepase3 抗体为 cell sig-naling Technology 公司产品; p27Kip1 抗体为 BD Bio-science 产品。抗鼠及抗兔二抗购于 Fisher Scientific 公司。ECL 化学发光试剂盒及感光胶片为 GE 公司产品。

　　1． 2 方法

　　1． 2． 1 细胞来源及培养: 人卵巢癌细胞系 OV2008 为完成该实验的加拿大 york 大学生命科学系 chun peng实验室保存。用含 10% 胎牛血清( Sigma 公司产品) 、1% 青霉素链霉素( Invitrogen 公司产品) 的 ＲPMI 1640培养基( Thermo 公司产品) ，在 37℃，5%CO2培养箱中培养。

　　1． 2． 2 灵芝孢子粉工作液配制: 灵芝孢子粉由加拿大energene 天然药品有限公司提供。 将灵芝孢子粉500 mg溶于 10 ml DD-H2O 中配制成 50 mg / ml 的灵芝孢子液，高温灭菌、促溶，静置或离心后取上清，用0． 20 μm 微孔滤膜过滤器过滤除菌，即刻用于实验或作为储存液密封置于 4℃冰箱，保存 2 周，再次使用前70℃ 孵育 10 min。
1． 2． 3 WST-1 法检测灵芝孢子粉对人卵巢癌细胞增殖的抑制作用: 取对数生长期的 OV2008 细胞，0． 2%Trypsin 消化后，以每孔 4 000 个细胞接种于 96 孔培养板，培养过夜后试验组分别加入浓度为 0． 1、0． 5、1、2、2． 5 mg / ml 的灵芝孢子液，每个浓度设 5 个复孔，对照组 5 个孔同时更换培养液，分别于 24、48 h 进行比色检测细胞活力。按照试剂盒说明书于每一时间点每孔中加入 10 μl WST-1/ECS 溶液，培养箱培养30 min，充分振荡 1 min，酶标仪测定波长为 450 nmOD 值，计算药物对细胞生长的抑制率，细胞抑制率 =1 － 试验组平均 OD 值/对照组平均 OD 值 × 100%。IC50 用 Logit法计算。

　　1． 2． 4 细胞计数法检测灵芝孢子对人卵巢癌细胞生长抑制作用: OV20008 细胞消化后以每孔 10 × 104个细胞接种于 12 孔培养板，培养过夜后试验组分别加入浓度为 0． 1、0． 5、1、2 mg/ml 的灵芝孢子液，每个浓度设 3 个复孔，对照组 3 个孔加入不含药物的培养液。48 h 显微镜下拍照各组细胞形态，之后收获细胞，消化细胞后以 1∶ 1比例与台盼兰混合，光学显微镜下死亡细胞被染成蓝色，而存活细胞因有完整细胞膜存在不被染色，镜下用细胞计数器计数未染色的活细胞数目。

　　1． 2． 5 流式细胞技术测定卵巢癌细胞细胞周期分布:

　　取对数生长期的卵巢癌细胞系 OV2008，消化后接种100 × 104个细胞于6 cm 细胞培养板，培养过夜后实验组吸去原培养液，分别置入终浓度为 0． 5、1、2 mg/ml的灵芝孢子粉溶液，对照组加入不含药物的培养液，培养 24、48 和 72 h，收集细胞。0． 2% Trypsin 消化后离心，弃去上清液，1 × PBS 5 ml 洗涤后以 70% 冷乙醇固定，冰上放置 30 min 后直接上机测定或保存于 －20℃冰箱待测。上机前离心弃去冰乙醇，PBS 洗 2 次后以预染溶液( 0． 2% Triton-100、1 mmol/L EDTA) 洗涤一次，加 50 μg/ml 核糖核酸酶 A ( ＲnaseA) 及 50 μg/ml碘化丙啶( PI) ，避光染色60 min，经200 目尼龙网过滤后，用流式细胞仪测定，计算出细胞周期分布情况。

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