学术期刊发表网 位置：木犀草素对急性肺损伤的干预和保护作用 时间： 2022-07-08 15:42:34 (12 )

摘要：急性肺损伤( acute lung injury，ALI) 是由多种原因引起的以肺泡毛细血管膜通透性增高为特征的肺损伤，是临床重症监护患者主要的死亡原因，病死率达到30% ～ 50%［1 －3］。ALI 病因复杂，

急性肺损伤( acute lung injury，ALI) 是由多种原因引起的以肺泡毛细血管膜通透性增高为特征的肺损伤，是临床重症监护患者主要的死亡原因，病死率达到30% ～ 50%［1 －3］。ALI 病因复杂，多种疾病可并发ALI，致病环节众多，其中过度失控的炎性反应和促炎、抗炎反应失衡是该疾病的主要发病机制，炎性细胞因子和趋化因子间的复杂网络调控在启动、放大和促进病理进程中起到重大作用［4］，迄今仍无有效治疗ALI 的方法和药物。木犀草属属于黄酮类化合物，因最初从木犀草科木犀草属草本植物木犀草的叶、茎、枝中分离出而得名，是一种天然色素组分，具有很高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调剂、抑菌等作用［5］。木犀草素的抗炎作用与抑制炎性介质的释放与核因子 κB( nuclear factor κB，NF-κB) 介导的基因表达有关。本文旨在探讨木犀草素对 ALI 是否有干预和保护作用及其在体内的可能作用机制。

　　1 材料与方法

　　1． 1 动物 健康雄性 ICＲ 小鼠，体重 18 ～ 22 g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号码:SCXK( 沪) 2008-0016。饲养于室温、充分给水和食物。

　　1． 2 试剂及药物 脂多糖 ( LPS) ( 大肠杆菌 O111:　B4，Sigma 公司，076K4020) ; 木犀草素 ( Sigma 公司) ;地塞米松磷酸钠注射液( 金陵药业股份有限公司，080201) ; 戊巴比妥钠( 国药集团化学试剂有限公司，WS 20060401) ; 小鼠白介素-1β( IL-1β) ELISA 试剂盒( A6071384) 、IL-6 ELISA 试剂盒( A6071377) 、肿瘤坏死因子-α( TNF-α) ELISA 试剂盒( A6071379) 均购自Ｒ＆D 公司; Braford 蛋白含量检测试剂盒、NF-κB p65Antibody、IκB-α Antibody、IκB-α ( Phospho-ser32 ) Anti-body、内参一抗( β-Actin) 、内参一抗( Lamin B) 、辣根过氧化酶标记的二抗均购于南京凯基生物科技发展有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。

　　1． 3 主要仪器 动物肺功能分析系统 ( AniＲes2005型，北京贝兰博科技有限公司) ; 酶标仪( 680 型，美国BIO-ＲAD 公司) ; 低温离心机( SH03014 型，美国科俊仪器公司) ; 超低温冰箱( 1500 型，日本 SANYO 公司) ，Western 电泳仪( 164-5051 型，美国 Bio-Ｒad 公司) ，分光光度计( UV-2540 型，日本 SHIMADZ 公司) 。

　　1． 4 方法

　　1． 4． 1 实验分组和模型的制备: 96 只小鼠随机平均分为两批，每批随机平均分为 6 组，分别为正常组、模型组、木犀草素低剂量组、木犀草素中剂量组、木犀草素高剂量组及地塞米松组，每组 8 只。木犀草素低、中、高剂量组于造模前 4 d 分别灌胃给予 25 mg/kg、50 mg / kg、100 mg / kg 的木犀草素，正常组和模型组均灌胃给予相同体积的 0． 9% 氯化钠溶液。小鼠腹腔注射 1%的戊巴比妥钠( 80 mg/kg) 后暴露气管，除正常组外，其 余 组 气 管 内 缓 慢 注 入 5% 的 LPS 溶 液( 5 mg/kg) ，造成小鼠急性肺损伤，正常组以相同方式注入相同体积的 0． 9%氯化钠溶液。

　　1． 4． 2 肺功能相关指标的检测 造模 6 h 后，取一批小鼠腹腔注射 1% 的戊巴比妥钠( 90 mg/kg) 深度麻醉，气管插管，将小鼠置于体描箱中。设置呼吸机的频率为 90 次/min，潮气量为 5 ml/kg，呼吸比为 15∶ 10。通过对动物气道压力( Press) 、肺容积变化( Volume) 的测量，计算出呼吸流速( Flow) 、平均吸气气道阻力( Ｒi) 、呼气气道阻力( Ｒe) 、肺动态顺应性( Cdyn) ，经AniＲes 2005 软件进行分析，40 min 后取出小鼠。
1． 4． 3 支气管肺泡灌洗液( BALF) 中细胞因子的测定: 取另一批小鼠，造模 3 h 后，结扎右肺，暴露气管并插管，向左肺注入 4℃ 0． 9% 氯化钠溶液 1 ml 进行支气管肺泡灌洗，重复 3 次。收集肺泡灌洗液并混匀，于4℃ 、1 500 r / min 离心 15 min。收集上清液，分装后保存于 － 70℃ 超低温冰箱中，ELISA 试剂盒检测检测IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的浓度。

　　1． 4． 4 肺组织病理检测: 灌洗结束后，立刻取右肺上叶以 10%甲醛溶液固定，HE 染色，制作常规石蜡病理切片。观察肺泡壁有无增厚、充血、炎性细胞浸润，间质有无炎症、水肿，肺泡有无坏死、出血等情况。

　　1． 4． 5 Western blot 测定肺组织中 p65、IκB-α、pIκB-α的表达: 将 100 mg 右肺组织置于 0． 5 ml 冰预冷裂解缓冲 液 中，用 十 字 匀 浆 器 匀 浆，充 分 裂 解。4℃，13 000 g，离心 10 min，保留上清液。Braford 法测定上清液中总蛋白浓度后，进行 SDS-PAGE 电泳。转膜、封闭并加入相应的一抗( NF-κB p65 抗体，1∶ 400; IκB-α抗体，1∶ 200; pIκB-α 抗体，1∶ 200) 4℃孵育过夜。PBST漂洗后，将膜与 HＲP 结合的二抗( 辣根过氧化酶标记抗体，1∶ 5 000) 室温下摇荡孵育 1 h。用 PBST 充分洗膜，然后将显影液加于 PVDF 膜上，室温放置 1 min。暗室中迅速曝光、显影、洗像。

　　1． 5 统计学分析 应用 SPSS 11． 5 统计软件，计量资料以 x± s 表示，采用单因素方差分析，P ＜0． 05 为差异有统计学意义。

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