学术期刊发表网 位置：肠道病毒71型诱导不同细胞焦亡的研究 时间： 2022-06-12 23:14:54 (12 )

摘要：14次 摘要：目的 探讨肠道病毒71型(EV-A71)感染不同细胞后细胞形态变化及诱导细胞焦亡的差异。方法 选用2株EV-A71毒株(分别分离自重症及普通病例)分别感染人横纹肌肉

14次 摘要：目的 探讨肠道病毒71型(EV-A71)感染不同细胞后细胞形态变化及诱导细胞焦亡的差异。方法 选用2株EV-A71毒株(分别分离自重症及普通病例)分别感染人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)、人喉表皮样癌细胞(Hep-2细胞)、人脑星形胶质瘤细胞(SW1088细胞)及人神经母细胞 --> 　　摘要：目的 探讨肠道病毒71型(EV-A71)感染不同细胞后细胞形态变化及诱导细胞焦亡的差异。方法 选用2株EV-A71毒株(分别分离自重症及普通病例)分别感染人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)、人喉表皮样癌细胞(Hep-2细胞)、人脑星形胶质瘤细胞(SW1088细胞)及人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞) 48 h后,观察细胞形态,并用流式细胞仪检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)活性。结果 RD、SW1088及SH-SY5Y细胞感染EV-A71 48 h后,感染组细胞出现明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),caspase-1活性细胞比例显著高于对照组,且分离自重症病例的EV-A71诱导的caspase-1活性显著高于分离自普通病例的EV-A71,分离自重症、普通病例的EV-A71诱导的caspase-1活性细胞及对照组的caspase-1活性细胞比例分别为,RD细胞:99.01%vs 80.94%vs 16.75%;SW1088细胞:93.13%vs 79.17%vs 9.48%;SH-SY5Y细胞:92.95%vs 68.05%vs 13.37%,P均<0.001。但Hep-2细胞感染48 h后未见明显CPE,且分离自重症及普通病例的EV-A71诱导的caspase-1活性细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(24.98%vs 23.78%vs 27.53%,P>0.05)。结论 EV-A71能诱导RD、SW1088及SH-SY5Y细胞发生caspase-1介导的焦亡,而不能诱导Hep-2细胞发生焦亡,且分离自重症病例的EV-A71诱导细胞焦亡的能力显著高于分离自普通病例的EV-A71。　　关键词：肠道病毒71型; 细胞焦亡; caspase-1; RD细胞; Hep-2细胞; SW1088细胞; SH-SY5Y细胞;　　肠道病毒71型(EV-A71)是引起疱疹性咽峡炎及手足口病的常见病原体之一,此外,EV-A71还可引起脑干脑炎、脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病,它是除脊髓灰质炎病毒之外的又一种重要的噬神经型病毒,能造成重症甚至死亡。有报道表明细胞坏死、细胞凋亡和自噬在 EV-A71 感染发病机制中起着重要作用,然而通过多种途径阻断细胞凋亡或自噬路径并不能完全抑制神经细胞病变[1-3],这提示还可能存在其他细胞死亡方式。本课题组的前期研究发现一种新的程序性细胞死亡方式即焦亡(pyroptosis)参与了EV-A71诱导的神经细胞病变[4]。焦亡是近年来确定的由多种病原体或非感染因素刺激导致的一种固有免疫反应,是伴随着大量炎性因子产生的特殊程序性死亡。细胞焦亡在形态上兼具凋亡和坏死的部分特征[5-7]。细胞焦亡的发生依赖于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)的活化,在经典途径中,细胞焦亡主要通过caspase-1介导,无活性caspase-1以酶原形式存在,可通过与炎性小体结合而被激活,激活后能活化白细胞介素(IL)-1β和IL-18,从而促进炎性因子成熟并释放,因而可通过检测caspase-1活性评价细胞焦亡发生情况。然而,不同的EV-A71毒株诱导细胞焦亡能力是否存在差异以及EV-A71对其他细胞是否也可诱导焦亡尚不清楚。本研究使用分离自普通手足口病患者及重症手足口病患者的EV-A71毒株感染不同细胞,观察细胞形态并分析细胞经典途径caspase-1介导的焦亡发生情况,以期为阐明EV-A71致病机制提供基础。　　1 材料与方法　　1.1 细胞及毒株　　细胞:人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)、人喉表皮样癌细胞(Hep-2细胞)、人脑星形胶质瘤细胞(SW1088细胞)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)均购自上海生命科学研究院细胞资源中心。EV-A71毒株:分离自手足口病合并脑炎患者的2015G03和分离自普通手足口病患者的K17245毒株,均由本实验室分离保存。使用RD细胞确定毒株的半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose,TCID50)和感染复数(multiplicity of infection,MOI),冻存于-80 ℃备用。　　1.2 主要仪器与试剂　　DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、PBS、青链霉素(美国Gibco公司);胰酶(中国福麦斯生物公司);Pyroptosis/caspase-1检测试剂盒(美国Immuno Chemistry Technologies公司);流式细胞仪(美国BD公司)。　　1.3 细胞培养及EV-A71感染　　RD、Hep-2、SW1088和SH-SY5Y细胞均生长于10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基中,在含5%CO2的37 ℃细胞培养箱进行培养传代,液氮冻存。上述 4 种细胞接种于6孔板中生长融合至70%～80%单层时,以MOI=1接种毒株,感染2 h后,用PBS清洗1遍,更换2%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基,置于含5%CO2的37 ℃细胞培养箱中继续培养。每种细胞均设空白对照组和实验组,每组设3个平行样。　　1.4 流式细胞仪检测细胞中caspase-1活性　　EV-A71 感染后培养48 h,胰酶消化收集细胞,1 000 r/min, 离心5 min,用1 ml含1%FBS的PBS重悬细胞进行计数。按照Pyroptosis/caspase-1检测试剂盒操作说明,每管取3×105个细胞终体积300 μl,加入1∶10稀释的染色液7 μl,混匀后置于37 ℃孵育1～2 h,每管加入1 ml 1×Wash Buffer,轻轻混匀后1 000 r/min,离心10 min,弃上清液,重复洗2次,最后用400 μl 1×Wash Buffer重悬细胞,使用流式细胞仪检测细胞caspase-1活性。　　1.5 统计学方法　　利用SPSS 19.0软件进行统计学分析,不同处理组间采用单因素方差分析(one-way ANOVA),若方差齐再利用LSD方法进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。　　2 结 果　　2.1 EV-A71感染不同细胞形态学变化　　EV-A71感染48 h后观察细胞形态,Hep-2细胞感染后无明显变化,RD、SW1088和SH-SY5Y细胞感染后出现典型的肠道病毒特征性细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),主要表现为细胞肿胀圆缩、破裂,胞质内颗粒物质增加,病变细胞脱落,对照组无明显变化,且2015G03感染组的CPE较K17245感染组更为明显,结果见图1。　　　　图1 EV-A71感染细胞48 h后的细胞形态(×100)　　2.2 EV-A71感染RD细胞caspase-1活性　　如图2所示,RD细胞感染2株EV-A71毒株48 h后,运用流式细胞仪检测caspase-1活性,对照组阳性细胞比例为16.75%,2015G03感染组阳性细胞比例为99.01%,显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);K17245感染组阳性细胞比例为80.94%,显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);2015G03感染组阳性细胞比例高于K17245感染组,差异有统计学意义(P<0.001)。　　　　图2 EV-A71感染RD细胞48 h后caspase-1活性　　注:a表示与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001),b表示两感染组比较差异有统计学意义(P<0.001)。　　2.3 EV-A71感染Hep-2细胞caspase-1活性　　如图3所示,Hep-2细胞感染2株EV-A71毒株48 h后,运用流式细胞仪检测caspase-1活性,对照组阳性细胞比例为27.53%,2015G03感染组阳性细胞比例为24.98%,K17245感染组阳性细胞比例为23.78%,3组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。　　　　图3 EV-A71感染Hep-2细胞48 h后caspase-1活性　　2.4 EV-A71感染SW1088细胞caspase-1活性　　如图4所示,SW1088细胞感染2株EV-A71毒株48 h后,运用流式细胞仪检测caspase-1活性,对照组阳性细胞比例为9.48%,2015G03感染组阳性细胞比例为93.13%,显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);K17245感染组阳性细胞比例为79.17%,显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);2015G03感染组阳性细胞比例高于K17245感染组,差异有统计学意义(P<0.001)。　　　　图4 EV-A71感染SW1088细胞48 h后caspase-1活性　　注:a表示与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001),b表示两感染组比较差异有统计学意义(P<0.001)。　　2.5 EV-A71感染SH-SY5Y细胞caspase-1活性　　如图5所示,SH-SY5Y细胞上感染2株EV-A71毒株48 h后,运用流式细胞仪检测caspase-1活性,对照组阳性细胞比例为13.37%,2015G03组阳性细胞比例为92.95%,显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);K17245组阳性细胞比例为68.05%,显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);2015G03感染组阳性细胞比例高于K17245感染组,差异有统计学意义(P<0.001)。　　　　图5 EV-A71感染SH-SY5Y细胞48 h后caspase-1活性　　注:a表示与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001),b表示两感染组比较差异有统计学意义(P<0.001)。　　3 讨 论　　EV-A71是引起手足口病的主要病原体之一,重症病例病情进展快,可出现脑干脑炎、神经源性肺水肿及循环衰竭甚至死亡[8-10]。EV-A71感染导致的神经系统病变机制还不清楚,细胞凋亡和炎症因子风暴被认为是导致重症及死亡的原因[11]。EV-A71感染中枢神经系统主要导致脊髓和脑干的灰质炎症,在被感染的神经元、星状胶质细胞及小胶质细胞中可见病毒颗粒,且在星状胶质细胞中的增殖更强一些[12]。　　本课题组的前期研究表明,EV-A71感染SH-SY5Y细胞48 h后出现明显的结构改变[13],本次研究用EV-A71感染 RD、SW1088及SH-SY5Y这3种细胞之后,48 h出现的CPE有变圆脱落、体积变小及细胞核皱缩等凋亡特征,同时也出现过度膨胀变圆的裂解式死亡现象,与细胞焦亡后出现的CPE特征相吻合。用特异性的Pyroptosis/caspase-1检测试剂对EV-A71感染后的细胞染色,运用流式细胞的技术方法进行caspase-1活性检测后,结果显示EV-A71感染RD细胞后诱发了明显的细胞焦亡现象,多个研究表明在小鼠后肢肌肉中可检测到EV-A71抗原,且EV-A71感染能导致急性弛缓性麻痹[14-16],因此EV-A71诱导RD细胞焦亡的现象表明细胞焦亡可能参与了肌肉细胞的病变。EV-A71感染也能导致SW1088和SH-SY5Y细胞发生焦亡,这验证了EV-A71感染能引发严重神经系统并发症的临床特征,与病理观察中EV-A71分布于神经元及神经胶质细胞一致,为进一步研究EV-A71致神经系统病变机制奠定基础。而EV-A71感染Hep-2细胞后并未观察到典型的CPE特征,也未检测到细胞焦亡,这可能是由于Hep-2细胞上不存在EV-A71的特异性受体,因此不能导致其发生焦亡,这也与临床上EV-A71较少引起呼吸系统病变一致。此外,本课题组发现在RD、SW1088、SH-SY5Y细胞上分离自重症病例的EV-A71毒株导致的细胞焦亡均显著高于分离自普通病例的毒株,因此,我们推测不同致病力的EV-A71毒株诱导细胞焦亡的能力不同。　　综上所述,EV-A71感染不同细胞后,诱导细胞焦亡能力存在差异且分离自重症病例的EV-A71毒株导致的细胞焦亡高于分离自普通病例的毒株,为进一步研究EV-A71感染所致神经系统并发症的机制提供了线索。　　参考文献　　[1]Lee YR,Wang PS,Wang JR,et al.Enterovirus 71-induced autophagy increases viral replication and pathogenesis in a suckling mouse model[J].J Biomed Sci,2014,21:80．　　[2]Lin L,Qin Y,Wu H,et al.Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits enterovirus 71 replication by down-regulating ubiquitin-proteasome 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