学术期刊发表网 位置：细胞色素P450 3A7羟化维生素D3的功能研究 时间： 2022-06-12 23:14:53 (12 )

摘要：14次 摘要：本研究通过体外生化实验研究细胞色素P450 3A7对维生素D3的羟化作用。根据GenBank报道的序列设计特异引物,扩增cyp3a7的编码区,将cyp3a7的编码区插入到pcDN

14次 摘要：本研究通过体外生化实验研究细胞色素P450 3A7对维生素D3的羟化作用。根据GenBank报道的序列设计特异引物,扩增cyp3a7的编码区,将cyp3a7的编码区插入到pcDNATM3.1/myc-His(-) A的XhoⅠ/Bam HⅠ,通过测序检测序列的正确性。pcDNA-CYP3A7及pcDNA分别瞬时转 --> 　　摘要：本研究通过体外生化实验研究细胞色素P450 3A7对维生素D3的羟化作用。根据GenBank报道的序列设计特异引物,扩增cyp3a7的编码区,将cyp3a7的编码区插入到pcDNATM3.1/myc-His(-) A的XhoⅠ/Bam HⅠ,通过测序检测序列的正确性。pcDNA-CYP3A7及pcDNA分别瞬时转染293T细胞,48 h后收集细胞,提取S9组分,用Bradford法测定蛋白质浓度。S9组分经12%SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting检测,用myc抗体作为一抗检测CYP3A7在293T细胞的表达水平。0.6 mg S9组分与1μmol/L维生素D3于37℃孵育30 min,用4倍体积的氯仿甲醇(体积比为3∶1)抽提,有机相在氮气流下吹干,残基用于HPLC分析。结果显示,重组表达CYP3A7的293T细胞的S9组分通过Western blotting检测到了特异的约60 kD的条带,对照样品未检测到特异条带的蛋白质。重组表达CYP3A7的293T细胞S9组分的孵育样品通过HPLC检测到了25-羟基维生素D3,对照样品未检测到25-羟基维生素D3。结果表明重组表达的CYP3A7羟化维生素D3生成25-羟基维生素D3。本研究为进一步探究还有哪些P450参与维生素D3在鸡体内的代谢,为阐明其代谢途径提供理论依据。　　关键词：鸡; 细胞色素P450; 代谢; 维生素D3;　　维生素D3除了经典的调节矿物质代谢和内环境稳态以外，还在肾外组织及细胞发挥重要的生物功能：调节靶细胞的增值、分化或功能，与肿瘤发生、免疫调节、抗炎效应等相关(Haussler et al.,2013;Deluca,2014;Adams et al.,2014)。维生素D3是影响蛋壳质量、硬度的重要因素，补充维生素D3有利于蛋壳质量提高，因此，维生素D3是影响雌鸡产蛋的重要因素(Kottferováet al.,2001)。维生素D3对禽类骨骼生长有重要影响，据报道高水平的维生素D3促进火鸡骨生长和骨骼矿化，因此，维生素D3对禽类产蛋和骨骼生长具有重要影响(Kim et al.,2011)。　　首先，维生素D3与维生素D3结合蛋白(DBP)结合，转运到肝脏，被细胞色素P450羟化为初具生物活性的25-hydroxyvitamin D3(25(OH)D3),25(OH)D3是维生素D3的主要循环形式，临床上应用25(OH)D3反映体内维生素D营养状态(Gupta et al.,2004)。25(OH)D3被转运到肾脏，被1α羟化酶转化为1α，25(OH)2D3，后者是体内最强生物活性维生素D3，因此也称为活性维生素D3。在人体内维生素D3的代谢途径及其代谢酶已经研究的较为深入，多个细胞色素P450可以在维生素D3的C-25羟化维生素D3生成25(OH)2D3，参与此反应的细胞色素P450主要包括CYP3A4、CYP2R1等(Chen et al.,2003;Gupta et al.,2004)。　　然而，禽类代谢维生素D3的P450未见报道。因此，探究维生素D3在鸡体内的羟化过程具有重要意义。据报道人的CYP3A4羟化维生素D3生成25(OH)D3，鸡CYP3A7也是鸡体内源及外源化合物代谢的关键羟化酶，序列比对分析表明鸡CYP3A7与人CYP3A4相似度最高。推测CYP3A7可能是参与VD3的代谢。本研究拟以鸡CYP3A7为研究对象，明确CYP3A7是否可以羟化维生素D3。　　1结果与分析　　1.1 cyp3a7克隆及真核表达载体构建　　用KOD FX和引物(F1,R1)从一月龄青脚麻鸡cDNA(实验室保存)扩增cyp3a7编码区，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，获得约1 500 bp条带(图1)，与GenBank报道的1 527 bp相符合。目的条带切胶回收纯化，将pMD18-T载体与PCR产物的连接，连接产物热激转化E.coli DH5α感受态，利用菌落PCR筛克隆，阳性克隆共5个(图2)。随机挑选两个阳性克隆提质粒和测序，序列正确的质粒保存备用，命名为pMD-CYP3A7。　　以质粒pMD-CYP3A7为模板，用KOD FX和引物(F2,R2)扩增基因cyp3a7编码区，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化回收(图3A)。将pcDNA和CYP3A7双酶切产物纯化回收、连接，连接产物热激转化E.coli DH5α感受态细胞，利用菌液PCR筛克隆(图3B)。筛选到5个阳性克隆，随机选择两个提质粒、测序。经测序鉴定扩增的片段去掉了基因3'的TGA，融合载体的表达标签myc-his，以利于检测。构建的哺乳动物真核表达质粒命名为pcDNA-CYP3A7。　　1.2 Western blotting检测重组CYP3A7融合蛋白在293T细胞的表达　　分别收集pcDNA-CYP3A7和空载体pcDNA瞬时转染293T细胞后，制备S9组分，用1μg、2.5μg、5μg S9组分经12%SDS-PAGE分离，转印到PVDF膜。表达载体pcDNA-CYP3A7在CYP3A7的3'融合Myc-His标签，Myc抗体检测比较特异，所以用Myc抗体做一抗检测CYP3A7的表达。重组蛋白质样品经Western blotting实验检测到约60 k D大小特异条带，与重组CYP3A7的大小相符合，并且当上样量倍增时条带亮度也随之增大。CYP3A7的编码区蛋白质为58.248 kD，末端融合载体的myc-his标签，其核酸序列为GGATCCGAGCTCGGTACCAAGCT TGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGG ATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATC ATCATTGA，翻译为氨基酸序列则为GSELGTKLG PEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH,3.452 kD，融合表达的CYP3A7共61.7 kD。而对照样品未检测到条带。结果表明重组CYP3A7在293T细胞成功表达(图4)。　　图1 cyp3a7 PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳　　　　Figure 1 1%w/v agarose gel electrophoresis of PCR products for cyp3a7　　注:M:DNA MarkerⅢ;箭头:cyp3a7的PCR产物　　图2 cyp3a7菌液PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳　　　　Figure 2 1%w/v agarose gel electrophoresis of bacteria liquid PCR products for cyp3a7　　注:M:DNA MarkerⅢ;1～14:cyp3a7的菌液PCR产物　　图3 cyp3a7 PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳　　　　Figure 3 1%w/v agarose gel electrophoresis of PCR products for cyp3a7　　注:M:DNA MarkerⅢ;箭头:cyp3a7的PCR产物;1～15:cyp3a7的菌液PCR产物　　1.3酶活实验　　pcDNA-CYP3A7和空载体pcDNA瞬时转染293T细胞，将制备的样品用于HPLC检测(图5)。标准品用的浓度比较高，用了10μmol/L的D3和25(OH)D3，分析标准品D3的色谱峰(图5A)，在12.9 min检测到一个特异的底物峰，分析标准品25(OH)D3的色谱峰(图5B)，出峰时间是5.9 min。用1μmol/L D3与pcDNA-CYP3A7瞬时转染293T细胞的S9组分孵育的样品(图5C)，底物D3和羟化产物25(OH)D3被探测到；1μmol/L维生素D3与pcDNA瞬时转染293T细胞的S9组分孵育的样品(图5D)，仅12.9 min检测到底物D3，未在5.9 min检测到羟化产物25(OH)D3。结果表明CYP3A7能催化维生素D3在C-25位单加氧生成25(OH)D3。　　图4 CYP3A7在293T细胞表达的Western blotting检测　　　　Figure 4 The expression of CYP3A7 in 293T cells was confirmed by Western blotting　　注:M:蛋白质Marker;1～3:pc DNA-cyp3a7转染293T细胞的S9组分1μg,2.5μg,5μg;4:pc DNA-CYP3A7转染293T细胞制备的S9组分5μg　　2讨论　　细胞色素P450是一个酶系，包括2种细胞色素(细胞色素P450,细胞色素b5)和2种黄素蛋白(NADPH-细胞色素P450还原酶,NAD-细胞色素b5还原酶)以及磷脂，其中起中心作用的是细胞色素P450及细胞色素P450还原酶。最早细胞色素P450酶被认为仅存在于动物，现在普遍认为细胞色素P450酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物体内(刘文波等,2016)。植物细胞色素P450酶是一类膜结合的亚铁血红素单加氧酶，催化羟基化、环氧化、脱氢、异构化、C—C键的裂解及脱卤、脱氨与杂原子氧化等反应。在植物生长、发育、天然产物的合成与异源物质的降解中发挥不同的作用(陈雷等,2014;程丽等,2017)。对于哺乳动物而言，细胞色素P450主要存在于肝脏，研究比较多的是CYP1、CYP2、CYP3家族，在内源性(如脂肪酸,类固醇,前列腺素,胆汁酸等)和外源性物质(临床药物,环境污染物等)的代谢过程中，起到重要作用(刘文波等,2016)。　　Ourlin等(2000)首次克隆到鸡CYP3A7(NM＿00-1001751.2)，曾用基因名为CYP3A37，其m RNA全长1 637 bp，编码508个氨基酸，高度保守，与人CYP3A4相似度高达69.7%，是CYP3A家族非常重要的细胞色素P450成员。Ourlin等(2000)利用17α策略构建CYP3A7的原核表达载体，简而言之，将鸡3A7的信号肽去掉，N端融合牛CYP17α信号肽，C端融合His标签。将重组表达的融合蛋白的编码区插入到pSE380表达载体的多克隆位点。利用溶解的膜与底物孵育研究CYP3A7的催化活性，研究结果表明重组表达鸡CYP3A7羟化CYP3A家族的特征底物睾丸酮和孕酮。Yuan等(2013)将鸡CYP3A7也利用17α策略构建CYP3A7原核表达载体，将CYP3A7的N端信号肽去掉，N端N端融合牛CYP17α信号肽，将重组表达的融合蛋白的编码区插入到pCWori+。利用溶解的膜研究CYP3A7的催化功能，体外生化实验结果表明重组表达的CYP3A7能羟化T-2毒素生成3'OH T-2毒素。以上结果显示，CYP3A7是鸡体内重要的羟化酶。　　图5 293T-CYP3A7代谢D3所产生的25(OH)D3的HPLC检测　　　　Figure 5 HPLC assay of D3metabolized to 25(OH)D3by 293T-CYP3A7　　注:A:标准品维生素D3;B:标准品25(OH)D3;C:1μmol/L维生素D3与pc DNA-CYP3A7瞬时转染的293T细胞S9组分孵育的样品,25(OH)D3被探测到;D:1μmol/L维生素D3与pc DNA瞬时转染293T细胞S9组分孵育的样品,25(OH)D3未被探测到　　以上2个报道均用了重组CYP3A7在大肠杆菌中原核表达，用溶解的大肠杆菌膜做体外生化孵育实验。本实验用真核体系表达CYP3A7，用293T细胞做表达宿主，因为293T是常用的表达外源基因的宿主细胞。本实验采用S9组分做实验，因为S9组分是应用合适的缓冲液匀浆组织或细胞后通过离心而获得的上清液(9 000 g,15 min)，包含细胞质和微粒体，易于获得，因此，常被用于测定药物及其他外源化合物的代谢分析(Zhu et al.,2017)。维生素D3及其羟化产物的检测方法常用HPLC和液质检测。现在，很多研究采用HPLC检测，本研究也用HPLC检测代谢产物和底物，与Yasuda等(2013)的检测方法相似。　　研究报道日粮中添加25(OH)D3比添加维生素D3效果明显。日粮中添加500 IU/kg的25(OH)D3可显著提高肉鸡肾脏1α-羟化酶和十二指肠m VDR mRNA表达水平，改善肉鸡生长性能和骨骼矿化(张金龙等,2017)。给1～21 d龄的火鸡饲料中补充25(OH)D3(69μg/kg)可提高免疫力，促进生长(Vazquez et al.,2018)。饲料中添加25(OH)D3比维生素D3效果明显，25(OH)D3对促进火鸡生长和骨矿物质代谢的生物效应是维生素D3的2倍多(Han et al.,2016)。所以，研究维生素D3在鸡体内的关键羟化酶以及代谢途径具有重要意义。　　本实验构建了真核表达载体pcDNA-CYP3A7，瞬时转染293T细胞，在293T细胞表达成功。提取的S9组分与底物维生素D3孵育，HPLC方法检测到了产物，而对照样品中未检测到产物。表明了CYP3A7羟化维生素D3生成25(OH)D3(图6)。　　本实验室也扩增鸡的CYP2R1，但是没有扩增出来，可能是由于其mRNA含量较少。还有哪些P450参与维生素D3在鸡体内的羟化反应还有待深入研究。本研究将进一步深入研究其他P450参与维生素D3在鸡体内的代谢的成员，并阐明其代谢途径。　　图6 CYP3A7羟化D3生成25(OH)D3　　　　Figure 6 D3was hydroxylated to 25(OH)D3by CYP3A7　　3材料与方法　　3.1实验材料　　载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A、鸡肝cDNA和293T细胞由陕西理工大学生工学院动物生理实验室保存；低质量分子标准免疫蛋白Marker购自于北京全式金生物技术公司；DNA MarkerⅢ购自于鼎国北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；KOD FX高保真DNA聚合酶购自于东洋纺(上海)生物科技有限公司；限制性内切酶XhoⅠ和Bam HⅠ、DNA A-Tailing Kit和pMD18-T Vector购自于宝生物工程大连有限公司；myc羊抗小鼠抗体和HRP标记的山羊抗小鼠Ig G购自于碧云天生物技术有限公司；色谱甲醇、维生素D3和25(OH)D3购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为分析纯购自国药集团。DMEM高糖培养基、血清、双抗(链霉素,青霉素)购自于赛默飞世尔(中国)。　　3.2基因克隆　　根据GenBank报道的CYP3A7的序列(Gene ID:414832)，设计引物(F1:ATGAACTTTCTTCCTTT CTTCTCC和R1:CTATGCCTTGGCAGTGTTGGTC)。用KOD FX从青脚麻鸡肝cDNA扩增CYP3A7的ORF,58℃退火，所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的条带。用DNA A-Tailing Kit在3'加A，按照说明书配反应液72℃反应20 min。pMD18-T载体与加了A尾的PCR产物连接(16℃,60 min)。连接产物热激转化E.coli DH5α感受态，37℃生长16 h后，菌液PCR筛选阳性转化子，将阳性转化子提质粒，英潍捷基公司用pMD18-T载体通用引物测序。　　3.3表达载体构建　　设计特异性引物(F2:CCGCTCGAGATGAACTT TCTTCCTTTCTTCTCC和R2:CGCGGATCCTGCC TTGGCAGTGTTGGTC,下划线标注限制性内切酶碱基)，在编码区的5'和3'分别引入XhoⅠ和Bam HⅠ限制性内切酶酶切位点，并去掉CYP3A7编码区TGA，在cyp3a7的3'融合载体的myc-His标签，利用pcDNATM3.1/myc-His(-)A的终止子终止翻译。以上述构建pMD-CYP3A7为模板，用KOD FX高保真酶扩增cyp3a7的编码区，58℃退火，其他步骤参见说明书。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的条带。用XhoⅠ和Bam HⅠ限制性内切酶双酶切PCR产物和pcDNATM3.1/myc-His(-)A载体6 h,DNA纯化试剂盒回收酶切产物。将回收的cyp3a7和载体的双酶切产物连接过夜，转化E.coli DH5α感受态，37℃生长16 h后，菌液PCR筛选阳性转化子，将阳性转化子进行DNA测序，保存序列正确的的质粒。　　3.4 293T细胞培养　　复苏293T细胞，在DMEM培养基完全培养基培养(含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素)。培养条件：37℃，5%CO2。　　3.5 293T细胞瞬时转染　　293T细胞接种于10 cm平皿，过夜，铺板率达到70%左右，pcDNA-CYP3A7和空载体pcDNA分别转染293T细胞。转染试剂用GenEscortTMⅠ(PEI)购自于上海起发实验试剂有限公司，详细操作步骤参见GenEscortTMⅠ的说明书。简而言之，8μg质粒和24μL PEI分别加入到500μL DMEM无血清培养基中混匀后静置5 min，将含PEI的DMEM加入到含质粒的DMEM中混匀后静置15 min，吸干平皿的培养基，然后将质粒PEI复合物加入到10 cm平皿中，补加1 m L完全培养基，4 h后补加8 mL完全培养基培养48 h后，收集细胞。　　3.6 Western blotting　　pcDNA-CYP3A7和空载体pcDNA转染后48 h，分别收集细胞，用PBS悬浮，超声破碎，用Bradford方法测定蛋白浓度。在1μg蛋白质样品中加入等体积的2×Loading Buffer混匀，煮沸失活，样品用SDS-PAGE分离。80 V，冰上转膜2 h。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗膜3次，每次5 min;myc小鼠抗体稀释1 000倍，4℃孵育过夜，洗膜3次，每次5 min;HRP标记的山羊抗小鼠Ig G稀释1 000倍，室温孵育2 h，洗膜3次，每次5 min。用BeyoECL Plus超敏发光液显色2 min，暗盒曝光2 min，显影2 min，定影15 min。　　3.7酶活实验　　转染后培养48 h的293T细胞收集，提取S9组分，详细步骤参见参考文献(Shang et al.,2013)。简而言之，用缓冲液2 mL 100 mmol/L Tris-HCl(pH值7.4)洗培养皿2次，在冰上用细胞刮刮下细胞，离心(4℃,300 g,3 min)，用缓冲液重悬，冰上超声破碎(10%功率,工作2 s,暂停9 s工作10次)，转移到新的离心管离心(4℃,9 000 g,15 min)，上清即为S9组分转移到新的离心管备用，用Bradford方法测定蛋白浓度。0.6 mg S9组分用于孵育实验，孵育反应的体系：500μL孵育总体积，1μmol/L D3，缓冲液为100 mmol/L Tris-HCl(pH值7.4),MgCl2终浓度15 mmol/L。在37℃预孵育5 min，加入NADPH终浓度为1 mmol/L起始反应，37℃反应30 min，加入4倍体积的抽提液(体积比为3∶1的氯仿和甲醇)终止反应，涡旋振荡2 min,3 000 r/min室温离心10 min。有机相转移到干净的棕色玻璃瓶中，在氮气流下吹干，200μL甲醇溶解，0.45μmol/L滤膜过滤，10μL用于HPLC检测。安捷伦1200(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)，色谱柱Hypersil BDS C18(大连依利特分析仪器有限公司,4.6 mmol/L×250 mmol/L,5μmol/L),1 mL/min,265 nm，流动相A是水，流动相B是甲醇，0～10 min,85%～100%B梯度洗脱；10～18 min 100%B等度洗脱，柱温40℃。　　参考文献　　[]Adams 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