学术期刊发表网 位置：陕北白绒山羊DRB1基因外显子2遗传变异分析 时间： 2022-06-12 23:14:53 (12 )

摘要：14次 摘要：本研究通过对123只陕北白绒山羊DRB1基因外显子2的遗传变异分析,旨在获得陕北白绒山羊DRB1基因的多态性及变异信息,为山羊抗病基因的挖掘研究提供基础资料

14次 摘要：本研究通过对123只陕北白绒山羊DRB1基因外显子2的遗传变异分析,旨在获得陕北白绒山羊DRB1基因的多态性及变异信息,为山羊抗病基因的挖掘研究提供基础资料。本研究共获得6条陕北白绒山羊DRB1基因外显子2序列,其中4条为首次发现。生物信息学分析表明DRB1 --> 　　摘要：本研究通过对123只陕北白绒山羊DRB1基因外显子2的遗传变异分析,旨在获得陕北白绒山羊DRB1基因的多态性及变异信息,为山羊抗病基因的挖掘研究提供基础资料。本研究共获得6条陕北白绒山羊DRB1基因外显子2序列,其中4条为首次发现。生物信息学分析表明DRB1位点具有较高的多态性,6条等位基因可能起源于2个祖先基因。在长期的进化过程中,DRB1位点受到了明显的选择压力作用,这种选择作用有助于陕北白绒山羊对当地气候的适应。蛋白质结构的预测证实了DRB1*1与其它等位基因间的差异性,说明核苷酸变异可能会引起蛋白质结构的改变,最终可能影响宿主对病原体的免疫应答。本次对陕北白绒山羊DRB1基因多态性的调查与分析有助于筛选疾病抗性和易感性MHC (Major histocompatibility complex)候选基因,进而可加速绒山羊抗病品系的改良与培育进程。　　关键词：陕北白绒山羊; DRB1; 遗传变异; 生物信息学; 抗病育种;　　陕北白绒山羊是陕北重要的优势家畜品种，具有投资小、周转快、收益高的特点，在陕北区域经济的振兴和促进老区人民群众的脱贫致富过程中发挥着重要作用。但是，在养殖中出现的疾病侵害常造成巨大的经济损失，制约着陕北白绒山羊产业的发展(黄帅等,2017,中国农学通报,33(26):107-111)。筛选山羊抗病相关的候选基因，探究其可能影响免疫的作用机理，是发展山羊产业经济的有效举措之一。当前，已发掘并鉴定出一些与羊生长、泌乳、繁殖等性状相关的重要功能基因，为相应的遗传育种奠定了良好基础(Guo et al.,2018;He et al.,2018)，但关于疾病性状相关的候选基因研究则相对较少。　　MHC(Major histocompatibility complex)基因全称为主要组织相容性复合体基因，可通过编码抗原呈递分子来启动机体的免疫应答。研究表明，MHC基因在免疫系统中发挥着核心作用，影响着动物的免疫应答与抗病性能(Aust et al.,2017)。MHC基因包含多个亚区(DR,DQ,DP等)，这些亚区中的基因座位有很多都已被证明具有高度的多态性，其多态性被作为反映种群在抵御寄生虫和生存能力上的重要指标(Ballingall et al.,2018)，也是筛选抗病相关候选基因的重要基础。　　关于羊的MHC基因与疾病关系的研究主要集中在DR、DQ亚区，相继发现了MHC基因与羊对细菌/病毒感染性疾病、寄生虫疾病的抗性或易感性。例如羊的DRB1基因与肺炎和肺腺癌的发生有相关性(Larruskain et al.,2010)；此后研究发现希俄斯岛羊DQA2*1101等位基因与腐蹄病的易感性有关(p<0.05)(Gelasakis et al.,2013)；此外，还发现羊MHC基因与布鲁氏菌病(陈月娥等,2014)、乳房炎(宋晓育等,2015)等相关。在寄生虫方面，对中国美利奴羊、哈萨克羊和多浪羊的DRB1基因研究发现了与包虫病抗性和易感性相关的基因型(Li et al.,2011)。研究表明肉用山羊的DRB1*1101等位基因表达量在被线虫感染的山羊组中显著高于抗性山羊组(p<0.05)，说明是线虫病的易感性等位基因(Corley and Savage,2015)。这些研究揭示了MHC基因在加快抗病新品系培育中具有巨大的潜力。但是，从上述研究结果中也发现不同品种羊的MHC等位基因和疾病的相关性存在着较大差异，因此，在抗病育种研究中需要挖掘品种特异性的抗病MHC等位基因。　　本研究以陕北白绒山羊为研究对象，通过对其DRB1基因外显子2序列的遗传变异分析，阐明陕北白绒山羊DRB1基因的多态性水平，进行系统发生分析与选择压力分析，并预测蛋白质二级和三级结构，从而为以MHC基因作为遗传选择标记的抗病绒山羊的人工培育提供参考依据。　　1 结果与分析　　1.1 PCR扩增　　PCR扩增后得到285 bp的目的片段，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测显示该片段无拖尾和杂带，条带明亮，特异性较好，可直接用于测序。将该产物送至生物公司测序，测序结果与已报道的绵羊和山羊DRB1序列比对分析后确定为DRB1基因的外显子2，说明该引物可用于陕北白绒山羊DRB1基因外显子2的群体扩增。　　1.2 PCR产物克隆和测序　　通过对123只陕北白绒山羊DRB1基因第2外显子克隆和测序，结果共获得6条不同的DRB1等位基因，所有序列均能翻译成正常的氨基酸序列(图1)，其中DRB1*1、DRB1*2等位基因分别与已报道的家山羊(Capra hircus)DRB1外显子2序列一致，另外4条(DRB1*3,DRB1*4,DRB1*5,DRB1*6)等位基因经BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)未发现完全匹配的序列，可能是陕北白绒山羊特异性的DRB1等位基因，说明该品种与其它山羊品种在MHC基因上有较大差异。根据HLA-DRB1序列推测出潜在的抗原结合位点(antigen binding sites,ABS)。　　1.3 多态性情况　　DRB1核苷酸多态位点共33个，占全部核苷酸序列的11.58%，其中单一多态位点29个，占87.88%，这些单一多态位点中转换位点有13个，颠换位点有16个。简约多态位点10个，占全部核苷酸序列的30.30%。氨基酸变异位点20个，占全部氨基酸序列的21.05%，说明核苷酸的变异大都引起了氨基酸的变化；其中，ABS的变异氨基酸比例达到30.00%(6/20)，说明ABS区氨基酸变异较高，这与其结合并呈递多种抗原的功能相吻合。上述变异位点充分说明DRB1基因具有较高的多态性且包含有丰富的遗传信息。　　1.4 系统发生及遗传距离　　系统发生分析显示陕北白绒山羊DRB1等位基因明显聚类为两支(图2)，说明这些基因最初可能是由2个等位基因分化而来，并且这些等位基因和绵羊DRB1基因具有很高的同源性，特别是DRB1*1。　　遗传距离计算结果表明6条等位基因是同源序列，平均遗传距离为0.03。从等位基因间的遗传距离可见(表1),DRB1*1、DRB1*6与其它序列的差异稍大，这与系统发生分析结果相一致。　　1.5 选择压力分析　　选择压力分析表明，陕北白绒山羊DRB1基因受到了明显的选择压力，在ABS和整个序列中非同义替换率(dN)都显著大于同义替换率(dS)(p<0.05)(表2)。　　图1 陕北白绒山羊DRB1外显子2氨基酸序列　　　　Figure 1 Amino acids sequence of exon2 of DRB1 in Shanbei white cashmere goats　　注:灰色位点表示潜在的ABS位点　　图2 DRB1基因外显子2的系统发生分析　　　　Figure 2 Phylogenetic analysis of DRB1 exon 2　　表1 等位基因间的遗传距离　　　　用PAML V4.7软件分析也发现DRB1基因受到了明显的正选择压力(表3;表4)。在M2a模型中，有14个DRB1位点受到正选择压力，其中71D、87G位点达到显著水平，58D位点达到极显著水平；在M8模型中有20个位点受到正选择作用，其中12P、57P、68I、75A和87G位点达到了显著水平，58D、71D位点达到了极显著的水平。　　Tajima's D值为-0.345，表明DRB1上存在针对特定等位基因的选择作用，在165～170 bp处受到正选择作用，D值达到极显著水平(p<0.001)(图3)。　　1.6 蛋白质二级结构预测　　在预测的蛋白质二级结构中，DRB1*5和DRB1*6的β转角、α螺旋、无规则卷曲及延展链所占比例都较一致，与其它序列相比，DRB1*5和DRB1*6的α螺旋比例较高。DRB1*3的β转角比例、DRB1*4的α螺旋比例均明显低于其它序列(表5)。　　表2 DRB1等位基因同义替换与非同义替换率　　　　图3 DRB1的Tajima's D分析　　　　Figure 3 Tajima's D analysis diagram of DRB1　　1.7 蛋白质三级结构预测　　对6条陕北白绒山羊DRB1序列的蛋白质三级结构进行预测，发现除DRB1*1预测的结构(图4A)不同外，其它等位基因预测的蛋白质三级结构(图4B)相同。　　2 讨论　　众多研究表明MHC基因具有极为丰富的多态性。由于个体间MHC等位基因可能存在着明显差异，因此能够呈递的抗原肽也有所区别，导致不同个体对相同病原体的抵抗力存在差异，这为筛选抗病相关候选基因奠定了基础。目前，在多种动物中都发现MHC基因与抗病能力相关联，从而有望培育出大量的抗病新品系(Caldwell and Siddle,2017;Hayashi et al.,2017)。例如，以MHC作为候选基因成功筛选出大西洋鲑抗病品系(Kj覬Glum et al.,2006)就说明了MHC基因在动物抗病育种中的巨大潜力，为包括陕北白绒山羊在内的抗病动物培育提供了崭新的思路。虽然国内外有不少关于绵羊、山羊MHC基因与疾病相关性的研究，但是，由于存在地域和品种差异，表现为不同品种羊对同一种疾病的抗性或易感性MHC等位基因也存在着较大的差异，因此，在抗病育种研究中需要挖掘品种特异性的MHC等位基因。而陕北白绒山羊作为陕北地区的优势品种，通过挖掘其抗病MHC基因提升抗病性能，可对地方经济的增速发挥重要作用。　　表3 最大似然法分析DRB1密码子进化模型及正选择位点　　　　表4 似然比检验　　　　图4 DRB1蛋白质三级结构预测　　　　Figure 4 Prediction results of protein tertiary structure of DRB1　　本研究通过对陕北白绒山羊DRB1基因外显子2调查，共获得6条不同的DRB1等位基因，核苷酸和氨基酸变异位点数分别占总数的11.58%和21.05%，说明该位点具有较高的多态性，这种多态性可为今后研究陕北白绒山羊MHC基因与疾病的相关性奠定基础，有助于获得较丰富的抗性和易感性等位基因，从而为基于MHC基因的抗病绒山羊的人工选育提供可行性。研究发现陕北白绒山羊DRB1基因受到了较强的选择压力，这种选择压力可能有助于其在长期的进化过程中适应当地粗饲条件，寒冷、风沙等气候环境。系统发生分析表明，陕北白绒山羊DRB1基因最初可能是由2个等位基因突变分化而来，且与绵羊的相应位点有很高的同源性。　　表5 DRB1蛋白质二级结构预测　　　　对获得的序列进行蛋白质二级结构预测，发现DRB1*1的β转角比例最大，而β转角多出现在蛋白抗原的表面，有利于形成抗原表位(王元元等,2017)。在对蛋白质三级结构预测中出现两种结构，DRB1*1产生结构A，其它等位基因预测出的结构相同(图4B)。结合对应的核苷酸序列分析发现，DRB1*1与其它5条序列差异较大，在系统聚类图中可以体现，这说明核苷酸的差异可能会引起转录本结构差异，进而影响蛋白质的结构，而MHC分子作为抗原呈递分子，其结构的差异性使得不同MHC分子呈递的抗原种类也不相同，最终影响着动物体的免疫应答。本次调查和分析陕北白绒山羊DRB1基因的多态性将有助于为MHC基因与疾病的相关性研究奠定基础，从而为筛选疾病抗性和易感性候选基因提供依据，促进绒山羊抗病品系的改良与培育。　　3 材料与方法　　3.1 试验材料　　分别采集陕西省榆林市陕北白绒山羊血样123份至抗凝管中，迅速震荡混匀，-20℃保存备用。用血液基因组提取试剂盒(天根)分别提取基因组DNA。　　3.2 PCR扩增　　使用已发表的绵羊DRB1基因外显子2引物(陈月娥等,2014)(F:5'-TATCCCGTCTCTGCAG CA CATTTC-3';R:5'-CTCGCCGCTGCACACTGAAAC TCT-3')用于陕北白绒山羊DRB1基因外显子2的扩增。产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测无误后直接送公司测序，确定引物的正确性。将每10个DNA样品分为一组形成混合DNA模板分别扩增陕北白绒山羊DRB1基因外显子2序列。PCR采用25μL反应体系，其中，上、下游引物各1μL,2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，模板DNA 1μL和9.5μL的dd H2O。PCR仪程序设置为：94℃3 min;94℃30 s,63℃30 s,72℃30 s，循环30次后72℃10 min。　　3.3 PCR产物克隆和测序　　按照DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)说明书对PCR产物进行纯化，纯化产物连接至pMD19-T载体(TaKaRa)，转化DH5α感受态细胞(TaKaRa)，通过蓝白斑筛选并挑取阳性克隆，用M13引物扩增无误后测序检验多态性情况。　　3.4 数据统计分析　　在DNASTAR软件中使用SeqMan对测回序列和绵羊已报道的DRB1外显子2序列比对；将正确的核苷酸序列置于MEGA 7软件中翻译为氨基酸序列，并计算可变位点和遗传距离等，评估陕北白绒山羊DRB1基因的多态性；用Kimura双参数模型基于绵羊和其它偶蹄类动物的DRB1外显子2序列(OvarDRB1*0102,登录号:AM885929.1;Eqca-DRB1*00101,登录号:JQ254085.1)构建NJ树，探讨各等位基因间的进化关系，重复次数为1 000；用MEGA 7和PAML V4.7软件包分析作用在陕北白绒山羊DRB1基因上的选择压力和受到选择作用的氨基酸位点，用CODEML选择变异密码子的进化模型；用DNASP V5软件进行Tajima's D分析；相应的蛋白质二级结构由在线软件ExPASy中的SOPMA预测，三级结构由在线软件SWISS-MODEL预测。　　参考文献　　[]Aust S.,Felix S.,Auer K.,Bachmayr-Heyda A.,Kenner L.,Dekan S.,Meier S.M.,Gerner C.,Grimm C.,and Pils D.,2017,Absence of PD-L1 on tumor cells is associated with reduced MHC I expression and PD-L1 ex-pression increases in recurrent serous ovarian cancer,Sci.Rep.,7:42929　　[]Ballingall K.T.,Lantier I.,Todd H.,Lantier F.,and Rocchi M.,2018,Structural and functional diversity arising from intraand inter-haplotype combinations of duplicated DQA and Bloci within the ovine MHC,Immunogenetics,70(4):257-269　　[]Caldwell A.,and Siddle H.V.,2017,The role of MHC genes in contagious cancer:the story 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